Introdução
A fixação à base de paraformaldeído é um método amplamente utilizado em biologia celular e fluxos de trabalho relacionados à microscopia para preservar a morfologia celular e estabilizar estruturas biomoleculares. Os pesquisadores usam rotineiramente soluções fixadoras derivadas de paraformaldeído para preparar amostras para imunocoloração, microscopia de fluorescência e técnicas analíticas laboratoriais relacionadas.
Uma dúvida comum que surge é: qual o tempo ideal de fixação? A resposta, porém, não é direta. O tempo de fixação não pode ser selecionado independentemente das características da amostra, da formulação do fixador, da temperatura e dos requisitos analíticos posteriores. O que funciona para um tipo de célula ou ensaio pode produzir resultados ruins em outro.
Este artigo explica por que não existe um tempo universal de fixação de paraformaldeído e descreve os principais fatores que influenciam as condições de fixação. Ele também fornece orientação sobre o que os compradores e usuários de laboratórios devem verificar ao selecionar produtos de paraformaldeído para aplicações de fixação.
Como funciona a fixação à base de paraformaldeído
Paraformaldeídoé um polímero sólido de formaldeído. É comumente usado para preparar soluções fixadoras aquosas de formaldeído. Em solução, o paraformaldeído despolimeriza para liberar formaldeído, que é o agente ativo de reticulação.
O formaldeído reage com grupos amina nas proteínas para formar adutos de metilol, que podem reagir ainda mais com grupos nucleofílicos adjacentes para formar ligações cruzadas de metileno. Estas reações de reticulação ajudam a preservar a morfologia celular e a estabilizar as estruturas biomoleculares, imobilizando proteínas e outras macromoléculas dentro do seu contexto celular.
A química da fixação do formaldeído é complexa e depende de múltiplas variáveis, incluindo pH, temperatura e ambiente químico das moléculas alvo. As condições de fixação devem, portanto, ser cuidadosamente adaptadas à amostra e à análise pretendida a jusante.
Por que o tempo de fixação varia
Tipo e espessura da amostra
Os requisitos de fixação variam consideravelmente entre os diferentes tipos de amostras. Células aderentes cultivadas, células em suspensão e seções de tecido apresentam diferentes desafios para penetração e reticulação do fixador.
A espessura e a acessibilidade da amostra influenciam diretamente a rapidez com que o fixador atinge todas as áreas da amostra. As condições validadas para células cultivadas não devem ser automaticamente aplicadas a amostras de tecidos mais espessos. A fixação de tecidos requer protocolos específicos para amostras porque os requisitos de fixação dependem fortemente do tipo de tecido, tamanho, espessura, método de fixação e análise a jusante.
Concentração e Formulação Fixadora
A concentração do fixador é uma variável importante na fixação à base de paraformaldeído. No entanto, a concentração e o tempo de exposição interagem com outros fatores, como temperatura, permeabilidade da amostra e composição do tampão. Estas variáveis devem ser avaliadas em conjunto dentro de um protocolo validado, em vez de serem tratadas como parâmetros independentes que podem ser simplesmente trocados.
Certas concentrações de paraformaldeído são comumente usadas como condições iniciais em protocolos publicados de fixação de células cultivadas, mas nenhuma concentração única deve ser tratada como um padrão universal. A concentração apropriada e o tempo de exposição para uma determinada experiência dependem do tipo específico de amostra, da temperatura de fixação, do ensaio a jusante e dos requisitos do protocolo laboratorial validado.
Temperatura e Cinética
A temperatura influencia a cinética de fixação e as características de preservação. As condições de temperatura ambiente são utilizadas em muitos protocolos, enquanto alguns métodos utilizam temperaturas reduzidas. A condição apropriada deve seguir o protocolo validado para a amostra e o ensaio.
Requisitos de aplicação downstream
As condições de fixação podem influenciar diferentes ensaios a jusante de maneiras distintas. O mesmo protocolo de fixação que funciona bem para uma aplicação pode ser abaixo do ideal ou até mesmo inadequado para outra.
Imunocoloração e Imunofluorescência
A fixação pode influenciar a acessibilidade do antígeno, e a extensa ligação cruzada pode reduzir a acessibilidade do epítopo para alguns alvos. Para aplicações de imunocoloração, as condições de fixação são normalmente otimizadas para preservar a antigenicidade, garantindo ao mesmo tempo que os locais de ligação dos anticorpos permaneçam acessíveis.
Citometria de Fluxo
As condições de fixação para citometria de fluxo dependem do alvo, dos reagentes, da estratégia de permeabilização e do protocolo de ensaio validado. As condições otimizadas para microscopia não devem ser transferidas automaticamente para fluxos de trabalho de citometria de fluxo.
A fixação também pode afetar a atividade enzimática e outras leituras moleculares, reforçando a necessidade de validação específica do ensaio.
Avaliando a qualidade da fixação
A qualidade da fixação deve ser avaliada utilizando a morfologia juntamente com o desempenho do ensaio a jusante pretendido. O exame microscópico pode fornecer informações preliminares úteis sobre se as células ou tecidos parecem adequadamente preservados, mas a aparência morfológica por si só não é suficiente para determinar se uma amostra está fixada de maneira ideal.
Encolhimento, má definição estrutural ou outras alterações morfológicas podem resultar de múltiplos fatores, incluindo condições de fixação, efeitos osmóticos ou artefatos de preparação de amostras. Por outro lado, amostras de aparência morfologicamente intacta ainda podem ter um desempenho ruim em ensaios posteriores se a fixação tiver comprometido a antigenicidade ou outras propriedades moleculares.
Para uma nova amostra ou ensaio, as condições de fixação podem ser validadas experimentalmente em torno de um protocolo estabelecido. Essa abordagem permite que os pesquisadores comparem o desempenho em uma variedade de condições de fixação e selecionem o protocolo que melhor atende aos seus requisitos específicos de downstream.
O manuseamento pós-fixação, incluindo lavagem ou extinção quando necessário, deve seguir o protocolo de ensaio validado.
Considerações de segurança e manuseio
As soluções fixadoras de paraformaldeído e contendo formaldeído são produtos químicos perigosos. A exposição ao formaldeído está associada a riscos significativos à saúde, incluindo irritação respiratória, sensibilização e potencial carcinogenicidade.
O pessoal do laboratório que trabalha com paraformaldeído ou fixadores de formaldeído deve:
- Revise a Ficha de Dados de Segurança (SDS) do produto específico que está sendo usado
- Seguir os procedimentos laboratoriais institucionais e os requisitos de segurança ocupacional aplicáveis
- Use controles de engenharia apropriados ao preparar e manusear soluções fixativas
- Use equipamento de proteção individual adequado, conforme especificado pelos protocolos de segurança institucionais
A preparação e utilização de fixadores de paraformaldeído devem ser realizadas apenas por pessoal treinado em instalações laboratoriais adequadamente equipadas.
O que os compradores de laboratório devem verificar
Ao avaliar um produto de paraformaldeído para aplicação de fixação em laboratório, os compradores devem verificar as seguintes informações do fornecedor:
- Classe e especificação exatas do produto
- Informações sobre pureza e impurezas relevantes, quando especificado
- Declaração de uso pretendido fornecida pelo fabricante
- Ficha Técnica (TDS)
- Ficha de Dados de Segurança (FDS)
- Certificado de Análise (CoA) para o lote específico
- Informações sobre armazenamento e prazo de validade
- Requisitos de protocolo laboratorial ou institucional aplicáveis
A identidade química por si só não deve ser usada para inferir a adequação para uma aplicação laboratorial biológica específica. O grau e a especificação apropriados para uma determinada aplicação laboratorial dependem dos requisitos do protocolo validado e da análise a jusante pretendida.
Se um grau ou especificação especializada for exigida pelo protocolo validado, os compradores deverão confirmar se a documentação do produto demonstra conformidade com esse requisito.
Conclusão
Não existe um tempo universal de fixação de paraformaldeído que se aplique a todas as células, tecidos ou ensaios. As condições de fixação devem ser selecionadas de acordo com as características da amostra, formulação do fixador, temperatura e requisitos de aplicação a jusante.
Um protocolo de fixação que funcione bem para uma aplicação não deve ser generalizado para todos os tipos de células ou contextos experimentais. Os investigadores devem seguir protocolos validados para o seu tipo específico de amostra e ensaio e avaliar a qualidade da fixação utilizando critérios morfológicos e o desempenho do método a jusante pretendido.
Para compradores de laboratórios, a adequação do produto deve ser confirmada a partir de grau documentado, especificação, informações de pureza, documentação de uso pretendido e requisitos de protocolo aplicáveis. A identidade química por si só é insuficiente para estabelecer a adequação para uma aplicação de fixação biológica.
Ao compreender os fatores que influenciam a fixação do paraformaldeído e seguir protocolos validados, os pesquisadores podem selecionar condições de fixação adequadas aos objetivos analíticos pretendidos.
Referências
- Hayat, MA (2000). *Princípios e Técnicas de Microscopia Eletrônica: Aplicações Biológicas* (4ª ed.). Imprensa da Universidade de Cambridge.
- Suvarna, SK, Layton, C. e Bancroft, JD (2013). *Teoria e prática de técnicas histológicas de Bancroft* (7ª ed.). Churchill Livingstone/Elsevier.